Las partículas de virus infecciosos y el ARN viral aumentaron a títulos significativos para ambos virus en todas las condiciones.
Publicado en Science
El síndrome respiratorio agudo severo (SRAS), causado por el coronavirus SARS-CoV, surgió en 2003 ( 1 ). A finales de 2019, se observó un coronavirus novedoso transmisible (SARS-CoV-2) para causar una enfermedad similar a la gripe que van desde síntomas respiratorios leves a graves lesiones pulmonares, fallo multiorgánico y la muerte ( 2 - 4 ). SARS-CoV y SARS-CoV-2 pertenecen al subgénero Sarbecovirus (género Betacoronavirus , familia Coronaviridae ) ( 5 - 7 ). El receptor SARS-CoV es la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) ( 8 , 9) Las proteínas pico de ambos virus se unen a ACE2, mientras que ACE2 bloquea la infección soluble por SARS-CoV, así como por SARS-CoV-2 ( 10 - 13 ). Se cree que la transmisión del SARS-CoV-2 ocurre a través de gotitas respiratorias y fómites. El virus se puede detectar en muestras del tracto respiratorio superior, lo que implica la nasofaringe como sitio de replicación. En el pulmón humano, ACE2 se expresa principalmente en el tipo epitelial alveolar células II y células ciliadas ( 14 - 16 ). Sin embargo, la mayor expresión de ACE2 en el cuerpo humano ocurre en el borde en cepillo de los enterocitos intestinales ( 14 , 17) Aunque los síntomas respiratorios dominan la presentación clínica de COVID-19, los síntomas gastrointestinales se observan en un subconjunto de pacientes ( 18 , 19 ). Por otra parte, el ARN viral se puede encontrar en frotis rectales, incluso después de la prueba de la nasofaringe se ha vuelto negativo, lo que implica la infección gastro-intestinal y una ruta de transmisión fecal-oral ( 20 - 22 ).
Los organoides son estructuras 3D, que se pueden cultivar a partir de células madre adultas (ASC) y recapitulan aspectos clave del órgano del que derivan las ASC. Dado que el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 se dirigen al pulmón, agregamos virus al epitelio de la vía aérea humana derivado de organoides cultivado en 2D y observamos que el SARS-CoV y el SARS-CoV2 infectan fácilmente los cultivos diferenciados de las vías respiratorias. ( Fig. 1A ). La inmunotinción revela que los virus se dirigieron a las células ciliadas, pero no a las células caliciformes ( Fig. 1, B y C ).
Los organoides del intestino delgado humano (hSIO) se establecen a partir de células madre epiteliales intestinales primarias, se pueden expandir indefinidamente en cultivo 3D y contienen todos los tipos de células proliferativas y diferenciadas del epitelio in vivo ( 23 ). Es de destacar que los hSIO han permitido el primer cultivo in vitro de norovirus ( 24 ). Exponemos hSIO ileales cultivados en cuatro condiciones de cultivo diferentes ('EXP', 'DIF', 'DIF-BMP' y 'EEC') a SARS-CoV y SARS-CoV-2 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1. Las hSIO cultivadas en medio de expansión Wnt-high (EXP) consisten principalmente en células madre y progenitores de enterocitos. Los organoides cultivados en medio de diferenciación (DIF) contienen enterocitos, células caliciformes y un bajo número de células enteroendocrinas (CEE). La adición de BMP2 / 4 a DIF (DIF-BMP) conduce a una mayor maduración (25 ) En la condición final, indujimos la expresión de NeuroG3 de un vector transfectado establemente con doxiciclina para aumentar los números de EEC (fig. S3D). Las muestras fueron cosechadas en múltiples puntos de tiempo después de la infección y procesadas para los análisis dados en las Figs. 2 a 5 . Tanto el SARS-CoV como el SARS-CoV-2 infectaron hSIO de forma productiva según lo evaluado por qRT-PCR para secuencias virales y por titulaciones de virus vivos en células VeroE6 (ver Fig. 2 para organoides lisados ??y Fig. S1 para sobrenadante de organoides). Las partículas de virus infecciosos y el ARN viral aumentaron a títulos significativos para ambos virus en todas las condiciones. Dado que el medio EXP soportaba la replicación de virus ( Fig. 2, A y E), los progenitores de enterocitos parecían ser un objetivo viral primario. Los organoides diferenciados (DIF; DIF-BMP) produjeron niveles ligeramente más bajos (no estadísticamente significativos) de virus infecciosos ( Fig. 2 y Fig. S1). En los organoides inducidos para generar EEC, los rendimientos de virus fueron similares a los del medio EXP ( Fig. 2, D y H ). En los hSIO diferenciados, los títulos de SARS-CoV-2 permanecieron estables a las 60 horas después de la infección, mientras que los títulos de SARS-CoV cayeron 1-2 log ( Fig. 2, B, C, F y G) La última disminución no se observó en hSIO infectados crecidos en EXP. Los sobrenadantes de cultivo en condiciones de cultivo contenían niveles más bajos de virus infeccioso en comparación con los hSIO lisados, lo que implica que el virus se secretaba principalmente de forma apical (fig. S1, A a D). A pesar de esto, el ARN viral se detectó fácilmente en los sobrenadantes de cultivo que se correlacionan con los niveles de virus infecciosos dentro de los hSIO ( Fig. 2, E a H , y fig. S1, E a H).
La expresión de ARNm de ACE2 difería mucho entre las cuatro condiciones. EXP-hSIO expresan 300 veces menos ARNm de ACE2 en comparación con DIF-hSIO, cuando se analizan en masa (fig. S2). El tratamiento con BMP indujo una regulación ascendente de 6,5 veces del ARNm de ACE2 en comparación con el tratamiento con DIF solo. Como esto no produjo diferencias en la tasa de infección, la condición DIF-BMP no se analizó más a fondo.
Para determinar el tipo de célula objetivo, luego realizamos un análisis confocal en hSIO cultivadas en condiciones EXP, DIF o EEC. Se tiñeron dsRNA viral, proteína de nucleocápside viral, KI67 para visualizar células proliferativas, actina (usando faloidina) para visualizar bordes de cepillo de enterocitos, ADN (DAPI) y caspasa 3 escindida para visualizar células apoptóticas. En general, se observaron tasas comparables de infecciones virales en los organoides que crecen en las tres condiciones. Por lo general, observamos la tinción de los componentes virales (blanco) en células únicas raras a las 24 horas. A las 60 horas, el número de células infectadas había aumentado dramáticamente ( Fig. 3A ). Las células infectadas muestran invariablemente fenotipos de progenitores de enterocitos proliferativos (EXP; Fig. 3B , arriba) o ApoA1 + fenotipos de enterocitos (DIF; Fig. 3B, fondo). Es de destacar que el SARS-CoV también infecta fácilmente las células del linaje de enterocitos (fig. S3, A y B) como se muestra anteriormente ( 26 , 27 ). Algunos progenitores de enterocitos infectados estaban en mitosis (fig. S3C). Mientras que los organoides EEC produjeron títulos apreciables, nunca observamos infección de EEC de cromogranina-A + (fig. S3, D y E). Tampoco notamos infección de células caliciformes en condiciones de cultivo. A las 60 horas, la apoptosis se hizo prominente en los enterocitos infectados con SARS-CoV y SARS-CoV-2 (fig. S5). La proteína ACE2 se reveló fácilmente como un marcador de borde de pincel brillante y ubicuo en hSIO en medio DIF ( Fig. 3C) En hSIOs en medio EXP, la tinción de ACE2 fue mucho más baja, pero aún apical, en células ocasionales en un subconjunto de organoides que mostraron una morfología más madura ( Fig. 3C ). En organoides inmaduros (quísticos) dentro de los mismos cultivos, la señal de ACE2 estaba por debajo del umbral de detección. El porcentaje de organoides infectados en condiciones EXP y DIF se da en la fig. S4. La figura S5 muestra imágenes y cuantificación de células apoptóticas tras la infección.
La microscopía electrónica de transmisión no supervisada (TEM) ( 28 ) se realizó en muestras seleccionadas altamente infectadas. La Figura 4 muestra dos hSIO, seleccionados de 42 hSIO con imágenes a las 60 horas después de la infección por SARS-CoV-2. Estos difieren en el estado de la infección: mientras que la organización celular dentro del organoide 1 todavía estaba intacta ( Fig. 4A , organoide completo; B a D, aumento intermedio; E a K, aumento alto), se pueden ver muchas células desintegradas en el organoide 2 ( Fig. 4 , abajo; L, organoide completo; M a O, aumento intermedio; P a R, aumento alto). Se produjeron partículas virales de 80-120 nm en la luz del organoide ( Fig. 4I ), en el lado basolateral ( Fig. 4J ) y apical (Fig. 4K ) de enterocitos. Las vesículas de doble membrana que son el sitio subcelular de la replicación viral ( 29 ) se visualizan en la Fig. 4, E y P . Los núcleos en ambos organoides diferían de los núcleos en los organoides infectados simuladamente por una forma ligeramente más redondeada. El índice de contorno nuclear ( 30 ) fue 4.0 +/- 0.5 vs 4.3 +/- 0.5 para el conjunto de control. Había más heterocromatina (4N) y uno o dos nucleolos densos en el centro (4O).
Luego realizamos un análisis de secuencia de ARNm para determinar los cambios en la expresión génica inducidos por la infección por SARS-CoV y SARS-CoV-2 de hSIO cultivadas continuamente en medio EXP y hSIO cultivadas en medio DIF. La infección con SARS-CoV-2 provocó una amplia firma de citocinas y genes estimulados por interferón (ISG) atribuidos a las respuestas de interferón tipo I y III ( Fig. 5A y tablas S1 y S2), según lo confirmado por el análisis de Ontología Genética ( Fig. 5B ) . Una lista superpuesta de genes apareció en los organoides DIF infectados con SARS-CoV-2 (fig. S6 y tabla S3). El análisis de secuenciación de ARN confirmó la diferenciación de organoides DIF en múltiples linajes intestinales, incluida la regulación positiva de ACE2 (fig. S7). El SARS-CoV también indujo ISG, pero a un nivel mucho más bajo (tabla S4). Figura 5Cvisualiza la regulación de genes inducidos por SARS-CoV-2 en organoides infectados por SARS-CoV. Esta inducción fue similar a las infecciones con otros virus como norovirus ( 31 ), rotavirus ( 32 ) y enterovirus ( 33 , 34 ). Un estudio reciente ( 35) describe una firma antiviral inducida en líneas celulares humanas después de la infección por SARS-CoV-2. Mientras que la respuesta de ISG es más amplia en los organoides intestinales, los conjuntos de genes inducidos están muy de acuerdo entre los dos conjuntos de datos (fig. S8). Una sorprendente similitud fue la baja expresión de los interferones tipo I y III: solo notamos una pequeña inducción del interferón tipo III IFNL1 en los organoides infectados con SARS-CoV-2. En los organoides infectados con SARS-CoV, no observamos ninguna inducción de interferón tipo I o tipo III. Confirmamos estos hallazgos mediante ELISA en sobrenadante de cultivo y qRT-PCR, que además de IFNL1 recogieron niveles bajos de interferón IFNB1 tipo I en SARS-CoV-2 pero no en organoides infectados con SARS-CoV (fig. S9). La inducción específica de IP-10 / CXCL10 e ISG15 por SARS-CoV-2 también fue confirmada por ELISA y qRT-PCR, respectivamente (fig. S10). Como en (35 ), ambos virus indujeron una breve lista de genes de citocinas, aunque a niveles modestos. Para una comparación con ( 35), vea la fig. S11. En conjunto, estos datos indican que el SARS-CoV-2 induce una respuesta de interferón más fuerte que el SARS-CoV en los HIO.
Finalmente, la infección se repitió en un segundo experimento en la misma línea de HIO ileal y se analizó después de 72 horas. El análisis incluyó la titulación viral (fig. S12), imágenes confocales (fig. S13) y secuenciación de ARN (fig. S14). Este experimento esencialmente confirmó las observaciones presentadas anteriormente. Un experimento cualitativo limitado que aplicó el análisis confocal demostró la capacidad de infección de otras dos líneas disponibles en el laboratorio (una ileal, una duodenal) de donantes independientes (fig. S13). Este estudio muestra que el SARS-CoV y el SARS-CoV-2 infectan las células del linaje de enterocitos en un modelo de organoide intestinal humano. Observamos tasas de infección similares de precursores de enterocitos y enterocitos, mientras que la expresión de ACE2 aumenta ~ 1000 veces tras la diferenciación a nivel de ARNm (fig. S2). Esto sugiere que niveles bajos de ACE2 pueden ser suficientes para la entrada viral.
El SARS-CoV-2 es el tercer coronavirus altamente patógeno (después del SARS-CoV y el MERS-CoV) que salta a los humanos en menos de 20 años, lo que sugiere que es probable que se produzcan nuevos efectos secundarios de coronavirus zoonóticos en el futuro. A pesar de esto, hay información limitada disponible sobre la patogénesis y transmisión del coronavirus. Esto se debe en parte a la falta de modelos celulares in vitro que modelen con precisión los tejidos del huésped. Muy recientemente, se demostró que las células iPS humanas se diferenciaban hacia una replicación de soporte del destino renal del SARS-CoV-2 ( 13 ). Nuestros datos implican que los organoides humanos representan modelos experimentales fieles para estudiar la biología de los coronavirus.
