Nuevo subgrupo de células B pro-angiogénicas aumenta en cáncer e inflamación crónica

Nuevo subgrupo de células B pro-angiogénicas aumenta en cáncer e inflamación crónica Las células B contribuyen a las respuestas inmunes a través de la producción de inmunoglobulinas

Publicado en Science

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Las células B contribuyen a las respuestas inmunes a través de la producción de inmunoglobulinas, la presentación de antígenos y la producción de citocinas. Se han informado varios subconjuntos de células B con distintas funciones y perfiles de citocinas polarizadas. En este estudio, utilizamos el análisis transcriptómico de clones de células B inmortalizadas para identificar un subconjunto de células B IgG4 + con una función única. Estas células B se caracterizan por la expresión simultánea de citocinas proangiogénicas que incluyen VEGF, CYR61, ADM, FGF2, PDGFA y MDK. En consecuencia, los sobrenadantes de estos clones promueven eficazmente la formación de tubos de células endoteliales. Identificamos CD49b y CD73 como marcadores de superficie que identifican las células B proangiogénicas. CD49b + CD73 + circulanteLas células B mostraron una frecuencia significativamente mayor en pacientes con melanoma y esofagitis eosinofílica (EE), dos enfermedades asociadas con la angiogénesis. Además, se detectaron células B IgG4 + CD49b + CD73 + infiltrantes de tejido que expresan citocinas proangiogénicas en pacientes con EE y melanoma. Nuestros resultados demuestran un subconjunto de células B proangiogénicas no identificado previamente caracterizado por la expresión de CD49b, CD73 y citocinas proangiogénicas.

Se ha pensado durante mucho tiempo que la función de las células B se limita a la generación de células plasmáticas productoras de inmunoglobulinas. Sin embargo, las células B pueden ejercer una gama más diversa de efectores inmunes y funciones reguladoras. Distintos subconjuntos funcionales de células B se han identificado sobre la base de sus perfiles de producción de citoquinas. Se han reportado células inmunosupresoras B reguladoras (reg) ( 1 ) y otros subconjuntos potenciales de células B, como las células B efector 1 (Be1) y Be2, así como las células B productoras de interleucina-17 (IL-17) ( 2 , 3 ). Las células B pueden secretar una amplia gama de citocinas y acumularse en áreas inflamatorias crónicas y alrededor de las células tumorales. Su interacción con las células de los tejidos y las células tumorales y su contribución a la remodelación de los tejidos siguen siendo en gran medida preguntas abiertas.

La angiogénesis es un proceso fisiológico esencial que ocurre durante la embriogénesis, el desarrollo normal del tejido y la reparación después de una lesión. A través de una serie controlada de eventos, la angiogénesis permite que crezcan nuevos vasos a partir de vasos preexistentes para satisfacer las necesidades fisiológicas de los tejidos ( 4 ). La angiogénesis también juega un papel en el crecimiento tumoral ( 5 ) y participa en la remodelación de tejidos en condiciones inflamatorias crónicas como el asma y la esofagitis eosinofílica (EE) ( 6 ).

Una amplia gama de moléculas secretadas promueve este proceso a través de la interacción directa con las células endoteliales vasculares. Estos incluyen factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de hepatocitos, factores de guía axonal y angiopoyetinas ( 7 ). También se ha informado que otros factores, como el inductor angiogénico rico en cisteína 61 (CYR61) ( 8 ), andromedulina (ADM) ( 9 ) y midkine (MDK) ( 10 ), promueven la angiogénesis. La adenosina libre también promueve la angiogénesis tanto por sus efectos mitogénicos directos sobre las células endoteliales como por la inducción de factores proangiogénicos como VEGF, IL-8 y FGF a partir de células vasculares e inmunes ( 11).) Los niveles extracelulares de adenosina 5′-trifosfato (ATP) están significativamente elevados en tejidos inflamados e hipóxicos. Este ATP extracelular puede hidrolizarse rápidamente por ectonucleotidasas. CD39 es un ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa y es la enzima limitante de la velocidad en la conversión de ATP y adenosina 5′-difosfato en adenosina 5′-monofosfato (AMP) ( 12 ). El AMP se convierte luego en adenosina por la ecto-5′-nucleotidasa (NT5E), también conocida como CD73. CD39 se expresa en la mayoría de las células B y monocitos periféricos (> 90%) y se puede expresar en un subconjunto de células T CD4 + , células T citotóxicas y células asesinas naturales (NK) ( 12 ) mientras que CD73 se expresa en un 75% de las células B y un subconjunto de células T CD8 + , CD4 +Células T y células NK ( 12 ).

CD49b, también conocido como integrina subunidad alfa 2 (ITGA2), se expresa como parte del heterodímero de integrina α2β1 en plaquetas, células NK, células T y fibroblastos. α2β1 funciona como un receptor de colágeno. La subunidad β1 (CD29) se expresa en la mayoría de las células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. La coexpresión de CD49b y LAG-3 se ha informado como una firma de células T reguladoras tipo 1 (Tr1) ( 13 ).

La inmunoglobulina G4 (IgG4) puede considerarse como un isotipo de inmunoglobulina antiinflamatoria debido a su baja afinidad por unirse a los receptores de Fcγ, su incapacidad para fijar el complemento y su monovalencia funcional, que resulta de su reordenamiento de las cadenas pesadas de inmunoglobulina por un mecanismo llamado Intercambio de brazos fabulosos ( 14 , 15) No existe un isotipo de anticuerpo murino que comparta estas características con la IgG4 humana; por lo tanto, los modelos de ratón no son adecuados para estudiar estos mecanismos inmunológicos asociados con IgG4. La IgG4 parece desempeñar un papel en la inducción y el mantenimiento de la tolerancia inmune a los alérgenos al bloquear la IgE específica de alérgenos, y los anticuerpos IgG4 específicos de alérgenos aumentan significativamente durante el curso de la inmunoterapia específica de alérgenos y en individuos expuestos a altas dosis de alérgenos. como los apicultores y dueños de gatos ( 16 , 17 ).

Además de su papel potencial en la tolerancia inmune a los alérgenos, la IgG4 también se ha asociado con afecciones patológicas. EoE, melanoma y enfermedades relacionadas con IgG4 están asociadas con la remodelación del tejido estructural, incluida la angiogénesis. Se han informado respuestas mejoradas de IgG4 en pacientes con EE donde se encontraron altas cantidades de anticuerpos IgG4 contra alérgenos alimentarios asociados con EE. Estos pacientes no mostraron niveles elevados de IgE específica ( 18 ). Además, los niveles de IgG4 tisular se correlacionaron posteriormente con otros parámetros de la enfermedad, incluidos los recuentos de eosinófilos esofágicos, así como con la expresión de IL-4, IL-10 e IL-13 ( 19 ). Se ha informado un aumento de la angiogénesis en la mucosa esofágica de pacientes con EE pediátrica ( 20).) Se encontraron células B infiltrantes de tejido que expresan IgG4 cerca de tumores en pacientes con melanoma, y ​​estas células B asociadas a tumor se polarizaron para producir IgG4. Tanto los anticuerpos IgG4 específicos de tumor como los inespecíficos bloquearon las funciones tumoricidas mediadas por IgG1. Además, la IgG4 sérica se correlacionó inversamente con la supervivencia del paciente y la supervivencia libre de enfermedad ( 21 , 22 ).

En este estudio, identificamos células B que expresan IgG4 y producen citocinas proangiogénicas y tienen la capacidad de promover la angiogénesis. Además, mostramos que estas células se caracterizan por la expresión de CD49b y CD73. Las células con este fenotipo están elevadas en la circulación de pacientes con EE y melanoma y están presentes en los tejidos afectados. Por lo tanto, nuestros hallazgos revelan un subconjunto de células B proangiogénicas previamente no identificado que está asociado con la remodelación del tejido en condiciones inflamatorias crónicas y la angiogénesis tumoral.

RESULTADOS

Un subconjunto de células B promueve la angiogénesis.

Usando un método descrito previamente de inmortalización de células B ( 23 ), generamos un conjunto de 27 clones de células B de memoria, de los cuales 10 eran IgG4 + y 17 eran IgG1 +de ocho individuos. La generación y las características de los clones se muestran en la fig. S1 y tabla S1, respectivamente. Para determinar el perfil de expresión de citoquinas de cada clon individual, los clones de células B se estimularon durante 4 horas con un receptor de células B anti-B (BCR), después de lo cual se analizó la expresión de ARN usando secuenciación de próxima generación. Los clones de células B se agruparon sobre la base de su expresión de los 100 principales genes expresados ​​de forma más variable que codifican proteínas inmunomoduladoras secretadas (fig. S2). Este enfoque dio como resultado la identificación de un grupo de células B que muestran una marcada regulación de las citocinas con características promotoras de la angiogénesis conocidas. Todas las células B que comprendían este grupo “proangiogénico” eran IgG4 + ( Fig. 1A) El análisis de expresión diferencial [tasa de descubrimiento falso (FDR) <0.01, cambio log 2veces> 0.5] entre el grupo proangiogénico y los otros clones de células B no anogénicas mostró una regulación positiva significativa de los genes que codifican las citocinas que se sabe que promueven la angiogénesis, la remodelación del tejido y cicatrización de heridas como VEGFA , PDGFA , CYR61 , proteína morfogénica ósea 2 ( BMP2 ), homólogo de hendidura 2 ( SLIT2 ), ADM2 , FGF2 , sobreexpresión de nefroblastoma ( NOV ), fosfoproteína secretada 1 ( SPP1 ), PDGFC , crecimiento derivado de hepatoma proteína 3 relacionada con el factor ( HDGFRP3), miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral 11B ( TNFRSF11B ), CXCL8 (que codifica IL-8), MDK y otros ( Fig. 1, A y B ). Varios genes con efectos pleiotrópicos o desconocidos sobre la angiogénesis, incluidos el antagonista del receptor de IL-36 ( IL36RN ), IL36B , el antagonista del receptor de IL-1 ( IL1RN ), VGF y el factor de crecimiento transformante β2 ( TGFB2 ), también estaban regulados. Expresión de IL10 , IL16 , semaforina-4A ( SEMA4A ), quimiocina 22 con motivo CC ( CCL22 ) y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TNFSF10 ) se reguló negativamente en clones proangiogénicos. Si bien los efectos de IL-10, CCL22 e IL-16 sobre la angiogénesis siguen sin estar claros, ya que se han informado efectos pro y antiangiogénicos, se ha demostrado que TNFSF10 y SEMA4 regulan negativamente la angiogénesis ( 24 , 25 ). El perfil de expresión de citoquinas de este grupo proangiogénico fue notablemente estable, como lo indica el análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real realizado después de 3 semanas de cultivo con CD40L e IL-21 seguido de 4 horas de estimulación con anti-BCR ( Fig. 1, B y C) La expresión de las citocinas proangiogénicas VEGF-A, CYR61, FGF2 e IL-8 también podría inducirse en células B periféricas primarias (fig. S3). Las condiciones de cultivo utilizadas para la expansión de los clones de células B inmortalizadas (CD40L + IL-21) en combinación con la estimulación anti-BCR indujeron de manera más efectiva la producción de estas citocinas en las células B primarias (figura S3).

Un subconjunto de células B promueve la angiogénesis.

A ) Mapa de calor que muestra recuentos normalizados log 2 a escala de genes ( puntaje z ) de genes que codifican proteínas inmunomoduladoras secretadas que se expresan diferencialmente entre clones de células B proangiógenas B y no angiogénicas (FDR <0.01, cambio de log2 veces> 0.5). El cuadro superior indica genes con efectos proangiogénicos conocidos, el cuadro central indica genes con efectos desconocidos o pleiotrópicos sobre la angiogénesis, y el cuadro inferior indica genes con efectos antiangiogénicos conocidos. ( B y C ) Lee los valores de expresión por kilobase millón (RPKM) de los datos normales de suero de cabra (arriba) y la expresión del gen qPCR en tiempo real después de la expansión in vitro prolongada (> 3 semanas) (abajo) de proangiogénico ( n= 5) y clones no angiogénicos ( n = 5) (media ± SEM). * P <0.05 y ** P <0.01, prueba de Mann-Whitney. (B) Genes que estaban regulados al alza en clones proangiogénicos. (C) Genes que estaban regulados negativamente en clones proangiogénicos. ( D ) Imágenes representativas del ensayo de formación de tubos HUVEC para cuantificar el efecto proangiogénico de los clones de células B (barras de escala, 400 μm). Control negativo, IMDM + 2% FCS; control positivo, medio EGM con factores de crecimiento. ( E ) Análisis cuantitativo de la tasa de formación de tubos HUVEC inducida por sobrenadantes de clones de células B pro- y no angiogénicas (media ± SEM). * P <0.05 y ** P <0.01, prueba de Mann-Whitney.

Para evaluar la capacidad funcional de los clones de células B proangiogénicas, probamos su potencial para promover la formación de tubos de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) ( 26 ). Los sobrenadantes recogidos de clones de células B proangiogénicas estimuladas con anti-BCR indujeron un aumento de la longitud total del tubo (aumento promedio, 1,9 veces sobre el control) y el número de uniones (aumento promedio, 4,9 veces sobre el control) en el ensayo de formación del tubo ( Fig. 1, D y E , y Fig. S4), demostrando su capacidad funcional para promover la angiogénesis.

Las células B proangiogénicas se caracterizan por la expresión de CD49b y CD73

Para determinar los marcadores de superficie asociados con las células B proangiogénicas, observamos genes expresados ​​diferencialmente que codifican proteínas de la superficie celular. Esto dio como resultado la identificación de 20 marcadores de superficie que se expresaron significativamente de manera diferencial (FDR <0.01, log 2 veces de cambio> 0.5) entre clones de células B pro y no angiogénicas ( Fig. 2A ). De estos genes, PVRL2 (codificación CD112), NT5E(codificación CD73), CD276, ITGA2 (codificación CD49b), IL1R1 (codificación CD121a) y CDH2(que codifica CD325) mostró el perfil de expresión diferencial más uniforme con alta expresión en clones proangiogénicos y baja expresión en clones no angiogénicos. Se observó expresión superficial de CD49b y CD73 constantemente regulada por incremento en clones de células B proangiogénicas mediante citometría de flujo ( Fig. 2B ). CD49b y CD73 también se expresaron en un subconjunto de células B periféricas, mientras que las células B periféricas no expresaron CD112, CD325 y CD276, y todas las células B fueron positivas para CD53 ( Fig. 2C ). Sobre la base de estos datos, CD49b y CD73 representaron marcadores de superficie potenciales para la identificación de células B proangiogénicas.

Las células B proangiogénicas se caracterizan por la expresión de CD49b y CD73.

A ) Mapa de calor que muestra recuentos normalizados de log 2 aescala de genes ( puntaje z ) de genes que codifican marcadores de CD que se expresan diferencialmente entre clones de células B proangiogénicas y no angiogénicas (FDR <0.01, log 2 veces cambio> 0.5). ( B ) Análisis de citometría de flujo de la expresión de superficie CD73 y CD49b en clones de células B proangiogénicas (línea negra) ( n= 5) y no angiogénicas (línea roja) ( n = 20) (media ± SEM). La línea punteada gris indica control de isotipo. * P <0.05 y ** P <0.01, prueba de Mann-Whitney. ( C) Análisis de citometría de flujo de la expresión de superficie de CD73 y CD49b en células B de sangre periférica recién aisladas.

Las células CD73 + CD49b + B forman una población distinta entre las células B circulantes

La tinción de CD49b y CD73 en células B periféricas de individuos sanos reveló una población distinta de CD73 + CD49b + ( Fig. 3A ). El análisis de expresión de ARNm de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de citocinas proangiógenas por poblaciones de células B clasificadas en base a la expresión de superficie de CD49b y CD73 mostró que la expresión de TGFB2 , MDK , FGF2 , CYR61 y VEGFA estaba regulada en CD73 + CD49b + Células B en comparación con CD73  CD49b Células B ( Fig. 3B) La expresión superficial de CD39 así como el receptor VEGF FLT1 fue mayor en las células CD73 + CD49b + B ( Fig. 3C ). La frecuencia de las células B CD49b + aumentó significativamente después de 3 días de estimulación in vitro de células B totales con CD40L + IL-21, mientras que la estimulación de células B con CD40L + IL-21 condujo a una reducción de células CD73 +

 B ( Fig. 3D )

Las células B proangiogénicas muestran frecuencias incrementadas en la circulación y están presentes en el tejido esofágico de pacientes con EE.

Para demostrar una función relevante in vivo para las células B proangiogénicas, primero investigamos las biopsias de tejido y la sangre periférica de pacientes con EE. Observamos un aumento de 3,2 veces en la frecuencia media de células CD73 + CD49b + B circulantes en pacientes con EE en comparación con los controles sanos ( Fig. 4A ). Además, hubo una correlación positiva moderada entre la frecuencia de las células B circulantes CD73 + CD49b + y el número de eosinófilos en la lámina propia y el tejido estromal del esófago en pacientes con EE ( Fig. 4B) Además, la actividad transcripcional de varios genes de citocinas proangiogénicas se reguló significativamente en las biopsias esofágicas de EoE en comparación con las biopsias esofágicas de control. Estos incluyeron VGF , PDGFA , CYR61 , FGF2 y MDK , mientras que TGFB2 , VEGFA y ADM mostraron una tendencia hacia una mayor expresión ( Fig. 4C ). Un subgrupo de cinco pacientes con EE mostró una regulación al alza mucho mayor de estas citocinas. No se encontró correlación entre los niveles de expresión de citocinas proangiogénicas y la frecuencia de CD73 + CD49b + circulanteCélulas B o el número de eosinófilos en el tejido esofágico de pacientes con EE. Las células B CD73 + CD49b + purificadas aisladas de sangre periférica de pacientes con EE mostraron niveles transcripcionales más altos de VEGFA , TGFB2 , AMD y FGF2que las células CD73  CD49b  ( Fig. 4D ). La tinción con microscopía confocal de biopsias esofágicas demostró que las células B CD20 + y / o las células plasmáticas CD138 + estaban presentes en el 50% (9 de 18) de las biopsias esofágicas EoE ( Fig. 4E ). VEGF-A +Se detectaron células B en cuatro de nueve biopsias que contenían células B ( Fig. 4, F y H ). En siete de estos nueve tejidos (78%), se detectaron células B IgG4 + o células plasmáticas. Algunas de estas células B expresaron CYR61, así como CD49b y CD73 ( Fig. 4, G y H ).

El nivel de expresión de CD39 se reguló significativamente hacia arriba en las células B CD73 +CD49 + B infiltrantes de tumor de melanoma en comparación con las células CD73 + CD49b + B periféricas de controles sanos, así como en pacientes con melanoma ( Fig. 5C ). El cocultivo de células B con la línea celular de melanoma FM55 sola no alteró significativamente la expresión de CD49b o CD73, mientras que la estimulación con BCR redujo la expresión de CD49b inducida por IL-21 y CD40L en presencia o ausencia de FM55 (fig. S5).

Se detectaron células B infiltrantes de tumor cerca de los vasos sanguíneos CD31 + en ocho de los nueve tejidos tumorales analizados a frecuencias variables ( Fig. 5D ). Se detectaron células B VEGF-A + y CD73 + en el 75% (seis de ocho) de las secciones tumorales ( Fig. 5, E y G ). Sin embargo, pudimos observar células B doble positivas para VEGF-A + CD73 + solo en tres de estos seis (50%) tejidos ( Fig. 5, E y G ). Se detectaron células B CD49b + en el 50% de los tejidos que contenían células B infiltrantes. Todas las muestras que contenían células CD49b + también contenían CD49b + CD73 +Células B ( Fig. 5, E a G ). Se detectaron células B IgG4 + en todos los tejidos tumorales que contenían células B (ocho de nueve) ( Fig. 5, F y G ). De los tejidos que se tiñeron positivas para IgG4 + células B, 62,5% contenía IgG4 + CD73 + células B y 37,5% de los tejidos que positivas teñidas para IgG4 + células B contenía IgG4 + CD73 + CD49b + células B ( Fig. 5G ).

Microscopia confocal

Embebido en parafina secciones de melanoma desparafinación se sometieron y rehidratación (2 × 10 min en xilol, 2 × 3 min en 100% de isopropanol, 2 × 3 min en 96% de isopropanol, 3 min en 70% de isopropanol, y 2 × 5 min en H 2 O), seguido de la recuperación del antígeno hirviendo las secciones en tampón de citrato de sodio [citrato de sodio 10 mM y Tween 20 al 0,05% (Sigma-Aldrich) en PBS (pH 6)] en una olla a presión durante 4 min. Las muestras de EoE congeladas se cortaron con un microtomo (Leica CM3050S) con un espesor de 7 μm y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Antes de la tinción, las secciones se descongelaron y secaron al aire y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos.

Para las secciones congeladas y de parafina, la unión no específica se bloqueó incubando durante 25 minutos con Perm / tampón de bloqueo (1% de BSA, 0,2% de Triton X-100 y 10% de suero de cabra en PBS). Luego, las secciones se tiñeron secuencialmente con las siguientes combinaciones de anticuerpos: (I) CYR61 (seguido de tinción secundaria con IgG-AF405 de cabra anti-ratón), CD20 (seguido de tinción secundaria con IgG-AF488 de cabra anti-conejo), CD73 ( seguido de tinción secundaria con IgG2b-AF594 de cabra anti-ratón), IgG4-Dylight650 y CD49b-AF546, (II) CD138 (seguido de tinción secundaria con IgG-AF405 de cabra anti-ratón), CD20 (seguido de tinción secundaria con anti-cabra -rabbit IgG-AF488, CD73 (seguido de tinción secundaria con IgG2b-AF594 de cabra anti-ratón), VEGF-A-Dylight633 y CD49b-AF564, (III) controles de isotipo coincidentes. Los detalles sobre estos anticuerpos y diluciones se pueden encontrar en la tabla S6. Todos los anticuerpos se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente, y entre anticuerpos, se lavaron tres veces durante 5 minutos con PBS. Después de la tinción, las secciones se cubrieron con ProLong Diamond (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Y se secaron durante 24 a 72 horas antes de tomar las imágenes. Las imágenes fueron adquiridas y analizadas con un microscopio confocal ZEISS LSM780 y el software ZEN 2012.

Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) en modo lambda con un objetivo de inmersión en aceite de 40 × con los láseres (405 a 488 nm). Se usó el rango de datos de espectro completo, y los fluoróforos usados ​​se agregaron primero a la base de datos como tinción única; Además, se midió la autofluorescencia de los diferentes tejidos. Después de adquirir las imágenes, se realizó una desmezcla lineal, con los fluoróforos y la autofluorescencia. Luego, se realizó un estiramiento de histograma para mejorar la calidad de las imágenes. Las imágenes PMT se hicieron en el mismo lugar que las imágenes con las líneas láser para proporcionar una visión general del tejido. De cada tejido, cuatro imágenes de áreas que contienen células B CD20 + o CD138 +Se analizaron las células plasmáticas. En cada tejido, se determinó la presencia de células IgG4 + , VEGF + , Cyr61 + , CD73 + , VEGF + CD73 + , CD49b + y CD73 + CD49b + . Si las células que expresan estos marcadores se detectaron en un tejido, se puntuó como positivo. El porcentaje de tejidos positivos se calculó como la relación entre los tejidos teñidos positivamente para los marcadores y el total de tejidos analizados.

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