Se secuenciaron genomas completos de aislados para su caracterización in silico, incluida la caracterización del patotipo, la virulencia y la identificación de plásmidos.
Las cepas de E. coli productoras de toxina Shiga (STEC) son patógenos transmitidos por los alimentos que causan diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH) potencialmente mortal.
Cada año, las STEC causan aproximadamente 2,8 millones de enfermedades, 3.890 casos de SHU y 230 muertes en todo el mundo. Los serotipos O157 y no O157 causaron 2,363 y 3,646 casos en 2017 en los Estados Unidos, respectivamente.
La carne de vacuno es un importante producto agrícola de Puerto Rico, con 37,7 millones de dólares en ventas anuales. La caracterización de cepas de E. coli en bovinos de carne (<5 años de edad) y terneros (0 a 3 meses de edad) proporcionará datos que pueden ser utilizados para crear conciencia sobre su potencial patogenicidad para el análisis de salud pública.
Estudio
Se recogieron 35 muestras fecales en una explotación de ganado vacuno de Puerto Rico. Las muestras se recogieron del recto utilizando guantes estériles (bovinos) o hisopos estériles (terneros) y se transportaron en hielo a un laboratorio.
El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la UPR proveyó la autorización ética bajo el protocolo número 01-2017-IACUC-UPRAg. Las muestras se suspendieron en 10 mL de NaCl al 0.09% (1:10), y 1 mL se transfirió a caldo de soja tríptico. E. coli se identificó mediante cultivo y pruebas bioquímicas: Agar MacConkey-lactosa, azufre-indol-motilidad y rojo de metilo/Voges-Proskauer. Los medios se incubaron aeróbicamente durante 24 h a 37°C.
El ADN de una sola colonia se extrajo utilizando un kit Qiagen DNeasy Blood Kit, y se extrajo 1 mL de un cultivo Luria-Bertani durante 18 h a 37°C, se crearon bibliotecas genómicas separadas y se secuenciaron utilizando un Illumina MiSeq. Las lecturas de extremos emparejados (2×, 250 pb) se cargaron en GalaxyTrakr. Se utilizaron Skesa MLST v.0.0.3, VirulenceFinder v.2.0 y ECTyper v1.0.0 para caracterizar los tipos de secuencia (ST), la virulencia y los serotipos, respectivamente. Los filogrupos se identificaron in silico utilizando ClermontPhylotyper v21.03. El patotipo STEC se clasificó mediante la identificación de al menos uno de los genes stx1 y stx2. Se utilizaron ResFinder (v4.1), Virulence Finder (v2.0) y PlasmidFinder para identificar la resistencia, la virulencia y los plásmidos, respectivamente.
La longitud del ensamblaje osciló entre 4.635.908 y 5.549.290 pb. Los patotipos identificados incluían siete STEC (bovinos: 2/8, terneros: 5/8 terneros). Cuatro aislados portaban el subtipo stx2a, asociado al SHU. Se detectaron 15 ST, incluida una asociada al serotipo O157:H7. El gen intimin (eae) identificado en terneros (4/8) es característico de los aislados virulentos. El gen eae está codificado dentro del locus de enterocitos y borramiento (LEE) que es responsable de las lesiones en la mucosa intestinal, junto con la proteína efectora secretada (Esp), el receptor de intimina translocado (Tir) y otros efectores. Se identificaron nueve replicones de plásmidos IncF, que contribuyen a la propagación y la plasticidad de los genes de virulencia.
Resultados
Los resultados sugieren que los terneros de carne de Puerto Rico pueden ser una fuente de STEC. Hasta donde sabemos, proporcionamos la primera caracterización de referencia de la virulencia potencial de E. coli procedente de ganado vacuno en PR.
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